1 引言

　　光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)指的是，通过特定波长光的照射，使组织吸收的光敏剂(photosensitizer, PS)发生光化学反应，在有氧环境下，激发态的光敏剂将能量传递给周围的氧分子，生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)与相邻的生物大分子发生氧化反应，产生很强的细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡[1]。近年来，PDT作为一种辅助治疗方法被广泛地应用于口腔疾病的治疗中，包括牙体硬组织疾病、牙髓疾病、牙周炎症[2], [3]等。

　　近年来,激光光源被广泛地应用于PDT中。然而目前开发的所有激光器，由于制作原理和实用价值的原因,局限了其在生物医学方面的应用[4]。而LED具有的高效节能、寿命长、易维护、结构简单、电源小巧、价格低廉等特点，使其在家庭便携PDT的推广上，有着传统激光器所无法比拟的优势。

　　LED和激光器发出的光从本质上来说最大的区别在于单色性和相干性。由于PDT治疗中所用的光敏剂具有一个较宽的吸收带，通常为10-20nm，甚至更宽，而目前生产的LED的半波带宽可以达到±10nm，所以单色性对于治疗效果无显著影响[5]。进一步的研究认为，光的相干性会对光治疗产生影响并没有理论和数据基础[6]。 通过实验，本文不仅以实例证明了使用LED作为光源对牙周炎进行光动力治疗的可行性，还进一步探究了不同光照参数组合下的最优杀菌治疗方案，为将来推广家庭便携式PDT治疗提供了理论基础。

　　2 实验光源

　　新型光敏剂的强烈吸收带一般在650-850nm之间[1]，实验采用660nm波长红光LED配合亚甲基蓝(methylene blue, MB)作为光敏剂对普雷沃牙周细菌进行体外杀菌实验。该光敏剂对峰值波长为660nm的红光有着强烈的吸收，并释放出大量单态氧，产生细胞毒素，杀死细菌。为确保光敏剂能够被激活，必须先检测实验使用的LED阵列发出的光的波长范围是否能够满足需要。为此，本文首先采用光谱分析系统对LED光谱功率分布进行了测试。测试的结果如图1所示。

　　图1 实验用LED的光谱功率分布图

　　由上图可知，LED的峰值波长为657nm，光谱半宽度为20nm，能量主要都集中在MB的强烈吸收带上。虽然在单色性上LED阵列无法与激光相提并论，但如前文所述，PDT中使用的光敏剂吸收带带宽通常为10-20nm，甚至更宽，因此，实验采用的LED阵列完全能够满足治疗的要求。

　　3 实验内容

　　3.1 前期准备

　　3.1.1细菌液体培养

　　复苏从患者牙周脓肿中分离的耐药野生株，并将其密涂在厌氧基础培养基血平板(OXID、5%脱纤维羊血)上。将平板放置于35～37℃厌氧环境中(N2 80%，H2 10%，CO2 10%)孵育2天，得到成熟菌落。取一定量的成熟菌落于液体培养基中，在35～37℃厌氧环境中(N2 80%，H2 10%，CO2 10%)孵育36小时，得到第二代细菌。

　　3.1.2 细菌菌液浓度选择

　　取经过36小时孵育的菌液，用培养液进行稀释。取稀释后的样本在分光光度计OD600下比浊 ，测出相应的OD(OD, optical density)值，再比对之前已经做过的OD值与CFU值曲线，即可大致推断出菌液浓度的数量级。本实验取OD值为0.65-0.75的菌液(此时菌液浓度大致为107CFU/mL)。

　　3.1.3 紫外杀菌

　　将LED阵列、驱动、12孔细胞培养板、移液枪等实验要用到的各项器材置于超净台上，进行8min的紫外杀菌。

　　3.2 光照实验

　　3.2.1 实验分组

　　12孔细胞培养板编号如图2所示，其中有颜色标记的6个孔位将用于实验。记有光照条件为L+，无光照为L-;有光敏剂条件为M+，无光敏剂为M-，则6个孔位的实验条件如表1所示。

　　图2 孔细胞培养板编号图

　　表1 细胞培养板各孔位的实验条件

　　3.2.2 实验参数

　　取浮游菌液浓度为107CFU/mL，MB浓度为0.05μmol/mL。光照密度与光照时间的取值如表2所示。

　　表2 各组实验的光照密度与光照时间参数