3.2.3 实验步骤

　　①先在A1、A2、D2孔位加入5μLMB溶液，再加入500μL浮游菌液，孵育2分钟;

　　②在B1、B2、D3中加入对照菌液各500μL;

　　③将LED阵列扣在细胞培养板上，关闭超净台工作灯，打开LED电源，按照3.2.2节设定的实验参数对菌液进行照射，如图3所示;

　　④照射结束后，关闭LED，取出培养板中浮游菌液用于后期处理。

　　图3 用LED阵列照射浮游菌液

　　3.3 后期处理

　　3.3.1 菌液稀释

　　对A1、A2、B1、B2、D2、D3中的菌液以及细菌原液(共7个样本)分别进行若干次的10倍次稀释，以便进行平板菌落计数。为使计数值落在置信区间上，对每一个样本取6种不同浓度的菌液进行接种，同时考虑到预期的处理效果，每一个样本的稀释倍数如表3所示。

　　表3 各样本稀释倍数

　　3.3.2平板菌落计数

　　将稀释好的菌液接种在厌氧基础培养基血平板上，每个平板对应一个样本。平板划分为6个相同大小的区域，每个区域接种一种浓度的菌液。将完成接种的平板放置于35～37℃厌氧环境中孵育，2天后取出平板进行菌落计数。将统计出的菌落数，根据稀释的倍数和取样接种量换算出每个菌液样本的CFU值，从而得出样本的杀菌率，以判断PDT治疗是否有效。

　　4 实验数据及分析

　　4.1 实验数据

　　为准确测量处理后的各样本菌液浓度，对于每一个实验样本，本文选择了孵育后菌落数量落在置信区间的接种样本，并根据其稀释倍数，换算出原样本的菌液浓度。表4记录了每一组实验的原菌液浓度以及经过处理并孵育的实验样本菌液浓度。

　　表4 原菌液及经过处理后的各实验组的浮游菌液浓度

　　4.2 数据处理及分析

　　4.2.1 PDT治疗可行性分析

　　根据表4，以原菌液浓度为分母，实验样本菌液浓度为分子，可以计算出每个样本经过处理后的牙周致病菌存活率。图4(a)、(b)、(c)分别表示当光照密度为10、20、40mW/cm2时，在不同的照射时间下，各实验样本的致病菌存活率。从图中可以看出，虽然光照的参数有所不同，但是在每一个单独的实验组中，添加了光敏剂并接受光照的实验样本的细菌存活率都要低于其他的实验样本。

　　图4：(a)各实验组在10mW/cm2光照密度下的细菌存活率;(b)20mW/cm2光照密度下的细菌存活率;(c)40mW/cm2光照密度下的细存活率

　　考虑到孵育环境以及孵育时间对菌液浓度的影响后，改用双阴性对照样本(L-M-)的菌液浓度作为分母，以其他样本菌液浓度作为分子，求得的牙周致病菌存活率。图5(a)、(b)及(c)所示的是光照密度分别为10、20、40mW/cm2时，在不同的照射时间下，考虑了时间因素以后的各实验样本的牙周致病菌存活率。从图中可以更明显地看出，添加了光敏剂并进行光照的实验样本组的细菌存活率远低于其他样本组。而单独进行光照或添加光敏剂的实验样本，其细菌存活率随光照密度及光照时间的变化则显示出较大的离散性。由此可见，使用LED为光源的PDT对于牙周炎的治疗的确有效，使用光敏剂的同时对细菌进行光照能够产生比单独使用光敏剂或仅仅接受光照更好的杀菌效果。

　　图5：(a)考虑了时间因素后各实验组在10mW/cm2光照密度下的细菌存活率;(b)20mW/cm2光照密度下的细菌存活率;(c)40mW/cm2光照密度下的细存活率

　　4.2.2 PDT治疗的最佳光照参数

　　图6所示的是同时添加了光敏剂并进行光照的实验样本，在不同光照参数组合下的细菌存活率。从图中可以看出，当光照密度较低时(10-20mW/cm2)，致病菌的存活率主要取决与光照时间——随着光照时间的增加，细菌存活率显著降低;当光照时间超过16min后，细菌存活率趋于稳定，并保持在一个很低的水准(3%以下)。当光照密度较高时(40mW/cm2),细菌存活率随光照时间增加而下降的幅度大大增加，在照射4min后，致病菌的存活率就低至3%以下;同样的，在照射16min后，细菌存活率趋于稳定，并且保持在一个更低的水准(0.1%以下)。由于在实际治疗的过程中，对病人患处进行长时间的照射是十分不便的，且低光照密度照射治疗过后仍会保持有3%左右的细菌存活率。因此，本文认为，在实验的18组不同光照参数中，以40mW/cm2的光照密度对患处进行8min的照射是比较适宜的治疗方案。

　　图6 不同光照参数下的牙周致病菌存活率

　　5 结论

　　实验的数据表明，同时使用光敏剂并接受光照的实验组，较其他的对照组，浮游菌液中的牙周致病菌存活率大大降低，即该实验组的杀菌效果远好于其他组，LED光源应用于体外牙周致病菌的PDT治疗被证明有效。同时，从实验数据中还可以看出，光照时间越长，PDT治疗的杀菌率也就越高;当光照密度较高时，杀菌率随光照时间增加而上升的幅度大大增加。在实验的18组不同光照参数中， 40mW/cm2的光照密度配合8min的照射时间是比较适宜的治疗方案。本文的研究仅针对以LED为光源的PDT治疗对体外牙周致病菌的存活率的影响，至于PDT在临床上的治疗效果是否与体外实验相一致则有待将来进一步的研究。若临床试验也被证明有效，那么在不远的将来，便携的LED光源的PDT治疗仪则有望进入千家万户，PDT辅助疗法也会成为牙周治疗的一个常规性手段。

编辑：Cedar